CMO_BADH双基因植物表达载体的构建

・研究报告・　　　　　　　　　　BIOTECHNOLOGY　BULLETIN

2005年第5期　　　　　　　　

CMO,BADH双基因植物表达载体的构建

何宇锋1　刘君1　韩烈保1　陈其军2

(1北京林业大学草坪研究所北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部

重点实验室,北京　100083;2中国农业大学,北京　100094)

摘　要:　以pC1303质粒和pC1391质粒为基础,利用载体pBIUC和pBIB构建了分别有Ubi启动子、35S启动子的带有控制甜菜碱合成的CMO和BADH的植物表达载体pC13032Ubi2CMO235S2BADH,为进一步开展提高植物抗逆性基因工程提供了基础。

关键词:　双基因表达载体　甜菜碱　CMO　BADH

ConstructionofCMO2BADHDoubleGeneExpressionVector

HeYufeng1　LiuJun1　HanLiebao1　ChenQijun2

(1TurfgrassInstituteofBeijingForestryUniversity,TheKeyLaboratoryforSilvicultureandConservationofMinistry

ofEducation,BeijingForestryUniversity　100083;2ChinaAgricultureUniversity,Beijing　100094)

Abstract:　BasedonplasmidofpC1303andpC1391,doublegenevectorpC13032Ubi2CMO235S2BADHcontai2ningCMOandBADH,whichwerereleasedfrompBIUC,pBIBandcontrolledbyUbiand35Spromoterrespective2ly,wasconstructed.WithCMOandBADHcontrollingthesynthesisoflycine,theobtainedplanttransformationvectorcanbeappliedonplantsgeneticengineeringforstress2toleranceimprovement.

Keywords:　Doublegeneexpressionvector　Lycine　CMO　BADH

甜菜碱是一类广泛存在于植物体内的渗透保护剂,是重要的渗透调节物质,甜菜碱在植物中的积累,可提高植物对干旱、盐胁迫的适应性。高等植物中甜菜碱由胆碱经由两步氧化反应合成:胆碱→甜菜碱醛→甜

菜碱,其中由胆碱单氧化物酶(CMO)催化的第一步氧化反应,甜菜碱醛脱氢酶(BADH)催化第二步氧化反应,使用CMO和BADH单基因表达载体的转基因植株都提高了一定的抗旱耐盐碱性[1～6],而将CMO和

BADH构建到同一表达载体以及遗传转化的研究未见报道。

在草坪草的遗传转化方面,主要集中在抗虫[7]、抗除草剂[8,9]、抗干旱以及滞绿等性状的研究,而在耐盐碱遗传转化方面的研究未见报道[10]。为了更进一步提高草坪草的抗旱耐盐能力,我们将CMO和BADH两个基因整合在同一个表达载体中,草坪草遗传转化正在进行中。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　菌种和质粒　载体pBIUC、pBIB、pCU1303质粒和pC35S1391质粒由本实验室保存。大肠杆菌菌

株DH10B,根癌农杆菌菌株LBA4404。1.1.2　酶和化学试剂　所有酶与试剂盒均为Promega、Biolab公司和华美生物工程公司产品。其它试剂均为分析纯。1.2　实验方法

收稿日期:2005204213

基金项目:国家转基因植物研究与产业化专项项目\"抗干旱、耐盐碱基因工程黑麦草、草熟禾新品种选育\"资助(J20022B2006)国家863项

目(2001AA244082)资助

作者简介:何宇锋(19782),男,硕士研究生,E2mail:heyufenggnefuyeh@163.com通讯作者:韩烈保,男,教授,博导,电话:010262337982,E2mail:hanlb@163.net

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1.2.1　基本方法　菌体培养,质粒提取,性内切酶酶切,大肠杆菌感受态细胞的制备和大肠杆菌转化等

常规分子生物学操作均参照《分子克隆实验指南》一书[11]。

1.2.2　琼脂糖凝胶中DNA酶切片段的回收　采用离心柱琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切片段,步骤参见试剂盒的说明书。

1.2.3　BADH的克隆　设计带有特殊酶切位点的引物,用pfu高保真酶对BADH进行PCR扩增,用PMD218T进行体载体连接。

μl。1.2.4　连接反应　将载体DNA和外源DNA片段加入一灭菌的EP管中,摩尔比为3∶5,总体积为8μl,加入T4DNA连接酶1μl,4℃放在冰上加入T4DNA连接酶缓冲液1反应过夜。2　结果与分析

2.1　CMO2BADH双基因植物表达载体的构建

2.1.1　植物表达中间载体pCUC1303的构建　用SmaⅠ和SacⅠ双酶切质粒pBIC,回收1.3kbCMO基因

片段,与经SmaⅠ和SacⅠ双酶切,回收的pCU1303质粒大片段连接,获得重组质粒pCUC1303(图1～2)。

图2　重组质粒导入大肠杆菌的PCR检测

图1　重组质粒pCUC1303的构建

(M为DL2000;1～3为PCR引物为CMO引物)

2.1.2　植物表达中间载体pC35SB1391的构建　设

计带有BamHⅠ酶切位点序列的PCR引物[12],用pfu聚合酶对pBIB进行BDAH高保真PCR扩增,回收扩增产物,与PMD218T体载体进行了连接,送交公司进行测序,然后用BamHⅠ和BstEⅡ双酶切PMD218T2BADH,回收BADH基因片段,将此基因片段与经BamHⅠ和BstEⅡ双酶切,回收的pC35S1391大片段连接,获得重组质粒pC35SB1391(图3～4)。

图3　重组质粒pC35SB1391的构建

图4　重组质粒导入大肠杆菌的PCR检测

(M为DL2000;1,2为PCR引物为BADH引物)

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　　　　　　　　何宇锋等:CMO,BADH双基因植物表达载体的构建

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2.1.3　双基因植物表达载体pCUC35SB的构建　用BstEⅡ和HindⅢ双酶切中间载体pC35SB1391,回收2.4kb的带35S启动子和BADH基因片段,与经BstEⅡ和HindⅢ双酶切,回收的中间载体pCUC1303大

片段连接,获得植物双基因表达载体pCUC35SB(图5～7)。

图7　重组质粒pCUC35SB的酶切鉴定

图5　重组质粒pCUC35SB的构建(M为DL2000;1～5为用BamHⅠ做酶切鉴定)

图6　重组质粒导入大肠杆菌的PCR检测

(M为DL2000;1～5用的PCR引物为BADH引物,

6～10用的PCR引物为CMO引物)

图8　重组质粒导入农杆菌的PCR检测

(M为DL2000;1～2用的PCR引物为BADH引物,

3～4用的PCR引物为CMO引物)

2.2　重组质粒导入农杆菌LB4404

提取转化后的根癌农杆菌的质粒,经PCR扩增都可获得1300bp和1500bp的目的带,证明重组质粒确

已转入根癌农杆菌(图8)。

3　讨论

3.1　启动子的选择

本研究构建了适于单子叶植物表达的CMO和BADH双基因植物表达载体。由于Ubi双启动子头对头的连接,形成回文结构,所以连接十分困难,因此在构建单子叶植物双基因表达载体时,用了两种不同的启动子(Ubi启动子和35S启动子)来驱动CMO和BADH基因。Ubi启动子头对头的连接十分困难,因而需进一步研究其改进方法。3.2　引入载体新的酶切位点

本研究在构建BADH单基因表达载体时,由于BADH基因一端没有合适的酶切位点,影响下一步的实验,因此在通过PCR获得BADH基因时,设计了带有BamHⅠ酶切位点序列的BADH引物序列[12],并在回收PCR产物后,送交测序公司测序,证实了带BamHⅠ酶切位点的BADH基因片段的获得,保证了实验的进行。3.3　选择标记的选择

)已被成功的用于选择标记,但是多数单子叶植物本身在许多植物中,新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ

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具有卡那霉素抗性,故而在单子叶植物的遗传转化中多采用潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)和除草剂抗性基

因(bar)作为选择标记[13],因此,我们在构建这一表达载体时选用潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)作为筛选标记,但其在成本上费用较高。

参考文献

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・国外动态・

日利用玫瑰长春花细胞悬浮培养生产姜黄素糖苷

AgricellReport2004年42卷4期29页报道:已知家姜黄(丝姜黄)(Curcumalonga,=C.domestica)根

茎中的黄色素即姜黄素有多种用途,例如除了用作食品色素外,还可用作药物。但由于这种黄色素在水中的溶解度很低,因而了其在药物和其他方面的应用。

最近,日本名古屋城市大学药学院和日本国立卫生科学研究所的科学家神永和水上及其同事发现,玫瑰长春花(Catharanthusroseus)的细胞悬浮培养可以将外源供应的姜黄素,转化为一系列的自然界中未见的葡糖苷。还指出,葡糖基化的效率取决于细胞的培养期。此外,在加入姜黄素之前,将培养基中的蔗糖浓度提高到8%,以及在培养中加入茉莉酮酸甲酯或水杨酸,也可以提高葡糖基化的效率。

μmol的葡糖苷/克细胞鲜重。利用神永等还发现,在最适培养条件下,玫瑰长春花细胞悬液可产生2.5

β上述方法获得的姜黄素葡糖苷,即姜黄素24′,4″2O22D2缩二龙胆酸二糖苷,是姜黄素产量的20百万倍。神永等说“:经试验,只有利用玫瑰长春花的细胞悬浮培养系统,才能产生这些姜黄素糖苷。其他种类植

物的细胞悬浮培养,都没有类似的活性。”又说“:我们目前除正在对与姜黄素葡糖基化有关的葡糖基转移酶进行提纯和cDNA克隆外,还准备在实验动物中检测这些姜黄素糖苷的吸收、代谢和药理活性,从而评价利用这些葡糖苷作为前药或药物前体的可能性。汪开治