免疫组化步骤

免疫组化：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法

1)将石蜡切片置于烤片机烘烤２－３h,{因为做石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，所以应烤片2-3h,除非组织的抗原性较稳定，则时间可长一点}后可把烤好的组织切片，放在60℃烤箱中过夜，最佳时间控制在14-18h{乳腺病理处省略此步骤}。取组织切片于切片架，用吹风机吹至产生蜡液，不可靠太近，以免使组织切片局部温度过高，破坏组织切片。

2）常规脱蜡 ({二甲苯脱蜡，在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长}二甲苯I 20min 二甲苯II 20min二甲苯 Ⅲ20min 无水乙醇10min（清洗二甲苯）无水乙醇10min95%乙醇5min80%乙醇5min) {梯度酒精用无水酒精与蒸馏水配置}

目的：把水渗入组织切片中，给细胞创造一个水溶性环境

<以下步骤是为细胞染色做准备>

3）捞出，放入铁缸内，用凉清水冲洗3次{如果组织容易脱片，就尽量泡一下，这样脱片可以减少很多}；

4）将配好的柠檬酸盐抗原修复液（抗原修复液的量为稍高于横向放倒的切片架的高度）{EDTA配制方法：EDTA修复液使用比例：EDTA:蒸馏水=1:49,每次最好配制1000ml。EDTA修复液重复使用最好不要超过5次，并且3次之后要测PH值，测PH是否为9.0，如偏离太大则弃用。枸橼酸修复液只能用一次。修复的原因：因为常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，

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实际操作

结果使得抗原性物质形成醛键，羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇。另外，蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。在染色时，要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态}{用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也可，因其抗原修复效果比柠檬酸盐的好，可从另外的问题上着手}灌入高压锅中，不旋紧，盖上即可，210℃烧至沸腾后，把切片架放入横向放倒，旋紧锅盖，待喷气时，开始计时2min-2min30s, 如果组织不易染色，可延长修复时间，但一般不超过3min，否则容易掉片。

5）到时间后，把高压锅放入水池中用凉水冲至气体放出完，旋下锅盖，自然冷却至室温，大于30min。

6）冷却后取出切片架用凉清水冲洗3次，放入3% H2O2 罐中10min，目的：封闭过氧化物酶。【每天用前新放入10ml H2O2 】【配制方法：1000ml 3%的过氧化氢=100ml 30% 过氧化氢+900ml蒸馏水，（H2O2保存需避光）】

7）捞出后用凉清水冲洗多次，应注意H2O2 有腐蚀性，最后一次用PBS（磷酸盐缓冲液），PBS暂不倒掉，泡片子，拿去加血清封闭。

8）拿切片架，取出切片擦拭组织周围水分{防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色}，山羊血清{封闭血清一般是和二抗同一来源的，但不能与一抗来源一致，非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果}封闭10min，一张片约50ul，盖过组织，到时后去血清，加一抗，盖过组织，可用枪头划匀抗体至组织边缘以外，防止边缘效应。抗体稀释液（绿色）与抗体配比量（1:50或1:100）{需要预实验摸浓度}，一般要多配取几张片子的量，以免不够。

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实际操作

9）放入37℃孵箱2h{一抗孵育温度一般37度2h }或者4℃冰箱过夜。放入4℃冰箱过夜效果更好，过夜时间最好为14-16h。{注意：防止组织干片}

9-1）从37℃孵箱中拿出，用PBS冲洗3次，每次约3－５min。

9-2）从4℃冰箱取出后放在室温下复温30min{一抗4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用}，到时后用PBS冲洗3次，每次约3－５min。{应先倒去罐中之前的PBS，用新PBS清洗。防止之前其他抗体洗过后，与自身的抗体产生交叉污染}

10)用吸水纸把切片组织周围的水擦去，直接加入二抗（黄色），盖过组织，放入37℃孵箱{二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索}，孵育2５min.

11) 从37℃孵箱中拿出，用PBS冲洗3次，每次约3－５min。

12）用吸水纸把切片组织周围的水擦去，直接加入辣根过氧化物酶（红色），盖过组织，放入37℃孵箱，孵育20min.

12）从37℃孵箱中拿出，用PBS冲洗3次，每次约3min。

13）取空管，配DAB液。{DAB显色液配制：1mlDAB底物液加一滴浓缩DAB液,如本次做20张组织切片，共需DAB底物液为:20×50ul=1000ul=1ml,再加一滴浓缩DAB液）}用吸水纸把切片组织周围的水擦去，用移液管，滴DAB显色剂{① DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，若为阳性，在加入DAB液后很快显出浅棕色，显色时间﹤10min。若不呈阳性，显色时间不能超过10min。②DAB显色时间很短（如几秒或几

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实际操作

十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间③此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间④DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长}，盖过组织,待显色后立即装入切片架入放入盛水的缸中，用凉清水冲洗多次。

14）放入苏木精罐复染{染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可}>3min,实际约５－10分钟

15）再用凉水冲洗组织切片

16）放入1%盐酸酒精{分化作用，置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快，防止染色不深；分化的颜色过浅，可以复置于苏木素中染色）}中涮一下，立即捞出，用凉水冲洗{1%的盐酸酒精分化液配制：浓盐酸（即36%-38%盐酸）：1ml, 75%乙醇：99ml}

17）再放入氨水罐涮一下，目的：返蓝，立即捞出，用凉清水冲洗。{0.2%氨水（PH值在7.5-8之间）配制：氨水（质量百分浓度25%-28%）：0.2ml, 自来水:100ml}

18）脱去细胞中的水分

（80%乙醇10min95%乙醇10min无水乙醇10min）

（二甲苯10min 甲苯10min）目的：使组织切片变透明，便于镜下观察

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实际操作

19）捞出，用树脂封片，一滴/张,在其上盖上小玻片

20）封好的组织切片，放入超净台中，打开抽风，冲一段时间，最后把切片放在窗台上凉2-3天，就可收起来。

免疫组化的试剂：主要由100％二甲苯，梯度酒精（100、95、80％）、PBS/TBS、3%双氧水、抗体封闭剂、酶底物(DAB常用)、苏木素、盐酸酒精、中性树胶、蒸馏水、柠檬酸修复液等。

酶底物DAB:DAB是HRP组化敏感底物，有致癌性，味苦涩。

ＡＱＰ１： 一抗是兔抗人抗体

二抗是羊抗兔抗体

β-catenin：一抗是鼠抗人β-连接素单克隆抗体，Ig分类是IgG1

血清：羊血清

器材 ： 铁磁缸、切片架 、滴管、加样枪、枪头、切片架、镊子、高压锅

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