一种用于检测两种抗原的组合型胶体金免疫层析试纸条[实用新型专利]

(12)实用新型专利

(10)授权公告号 CN 206756845 U(45)授权公告日 2017.12.15

(21)申请号 201720621365.5(22)申请日 2017.05.31

(73)专利权人 哈尔滨医科大学

地址 150081 黑龙江省哈尔滨市南岗区保

健路157号(72)发明人 程越　

(74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识产权代理

有限责任公司 11139

代理人 孙皓晨　马鑫(51)Int.Cl.

G01N 33/558(2006.01)

权利要求书1页 说明书6页 附图5页

()实用新型名称

一种用于检测两种抗原的组合型胶体金免疫层析试纸条(57)摘要

本实用新型公开了一种用于检测两种抗原的组合型胶体金免疫层析试纸条。所述试纸条由可折叠的左右两侧试纸条组成，其中：左侧试纸条包括底板以及位于底板上的从上到下依次相连的样品垫A、A蛋白金标垫、纤维素膜以及吸水纸，在所述的纤维素膜上设有质控线A、检测线A以及检测线B；右侧试纸条包括底板、位于底板上端的吸水纸以及位于底板下端的从上到下依次相连的纤维素膜、B蛋白金标垫以及样品垫B，在吸水纸以及纤维素膜中间开有可视窗，在所述的纤维素膜上设有质控线B，所述可视窗用于观察检测线A以及检测线B。采用该试纸条可以在一张试纸条上同时快速检测两种外源蛋白，操作简单，方便、适用于田间检测。

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权　利　要　求　书

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1.一种用于检测两种抗原的组合型胶体金免疫层析试纸条，其特征在于由可折叠的左右两侧试纸条组成，其中：

左侧试纸条(14)包括底板(17)以及位于底板上的从上到下依次相连的样品垫A(1)、A蛋白金标垫(2)、纤维素膜(6)以及吸水纸(7)，在所述的纤维素膜(6)上设有质控线A(3)、检测线A(4)以及检测线B(5)；样品垫A(1)、A蛋白金标垫(2)、纤维素膜(6)以及吸水纸(7)在结合处上下叠加；

右侧试纸条(15)包括底板(18)、位于底板上方的吸水纸(8)以及位于底板下方的从上到下依次相连的纤维素膜(10)、B蛋白金标垫(12)以及样品垫B(13)，在吸水纸(8)以及纤维素膜(10)中间开有可视窗(9)，在所述的纤维素膜(10)上设有质控线B(11)，所述可视窗(9)的位置与检测线A(4)以及检测线B(5)对应，用于观察检测线A(4)以及检测线B(5)；纤维素膜(10)、B蛋白金标垫(12)以及样品垫B(13)在结合处上下叠加。

2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述的质控线A(3)、检测线A(4)以及检测线B(5)平行于纤维素膜(6)的上下边，质控线A(3)靠近A蛋白金标垫(2)，检测线A(4)位于质控线A(3)以及检测线B(5)的中间。

3.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述的左右两侧试纸条中间有折线(16)，所述折线(16)上涂覆有防水涂层。

4.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述的底板(17)及/或底板(18)为PVC底板。5.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述的样品垫A(1)、样品垫B(13)、吸水纸(7)以及吸水纸(8)均为高吸水纸。

6.如权利要求5所述的试纸条，其特征在于所述吸水纸(8)由二层高吸水纸构成。7.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述的A蛋白金标垫(2)上含有可复溶的胶体金-A蛋白单克隆抗体复合物，所述的B蛋白金标垫(12)上含有可复溶的胶体金-B蛋白单克隆抗体复合物。

8.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述的A蛋白与B蛋白为同源物种中不同蛋白或两种非同源物种的两种蛋白。

9.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述的检测线A(4)包被有A蛋白单克隆抗体，所述的检测线B(5)包被有B蛋白单克隆抗体，A蛋白单克隆抗体与B蛋白单克隆抗体分别识别不同的抗原决定簇，所述的质控线A(3)包被有A蛋白抗抗体，所述的质控线B(11)包被有B蛋白抗抗体。

10.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述的底板的宽度大于样品垫、金标垫、纤维素膜以及吸水纸的宽度。

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一种用于检测两种抗原的组合型胶体金免疫层析试纸条

技术领域

[0001]本实用新型涉及一种胶体金免疫层析试纸条，特别涉及一种可用于同时检测两种抗原的组合型胶体金免疫层析试纸条，本实用新型性属于生物技术领域。背景技术

[0002]胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。另外，胶体金免疫快速诊断技术是一种固相标记新型免疫检测技术，以胶体金作为示踪物或显色剂，将胶体金标记在抗体上，再利用抗原抗体的反应原理，将金颗粒连接到抗原上，当抗原抗体反应达到一定程度时，出现肉眼可见的显色结果。采用胶体金免疫诊断技术，对抗体的生物活性影响小，干扰检测结果的因素小，具有广泛的应用前景。[0003]在中国专利申请号为CN200920244114，CN201620065094的专利申请分别公开了转基因大豆、玉米和水稻外源基因检测试剂盒以及一种组合型双向胶体金免疫层析试纸条。申请号为CN201620065094的专利申请所公开的试纸条的结构如图8所示，可见其实质上是将两种不同试纸条通过装置并连在了一起，并没有对试纸条的结构进行明显改进，与本实用新型构造原理不同。申请号为CN200920244114的专利申请公开了一种转基因大豆、玉米和水稻外源基因检测用标准分子试剂盒，包括一个带盖的封闭盒1，盒内装有载样板2和一个Ep管3，结构如图9所示，该检测试剂盒操作复杂、费时，只能用于实验室分析使用。发明内容

[0004]本实用新型克服了现有技术中的缺点，提供了一种可以快速检测这两种不同抗原的组合型试纸条，可以检测同源物种中不同抗原或两种非同源物种的两种抗原。[0005]为了达到上述目的，本实用新型采用的以下技术手段：[0006]一种用于检测两种抗原的组合型胶体金免疫层析试纸条，其由可折叠的左右两侧试纸条组成，其中：[0007]左侧试纸条14包括底板17以及位于底板上的从上到下依次相连的样品垫A1、A蛋白金标垫2、纤维素膜6以及吸水纸7，在所述的纤维素膜6上设有质控线A 3、检测线A 4以及检测线B 5；样品垫A 1、A蛋白金标垫2、纤维素膜6以及吸水纸7在结合处上下叠加；

[0008]右侧试纸条15包括底板18、位于底板上方的吸水纸8以及位于底板下方的从上到下依次相连的纤维素膜10、B蛋白金标垫12以及样品垫B 13，在吸水纸8以及纤维素膜10中间开有可视窗9，在所述的纤维素膜10上设有质控线B 11，所述可视窗9的位置与检测线A 4以及检测线B 5对应，用于观察检测线A 4以及检测线B 5；纤维素膜10、B蛋白金标垫12以及样品垫B 13在结合处上下叠加。[0009]其中，优选的，所述的质控线A3、检测线A4以及检测线B 5平行于纤维素膜6的上下边，质控线A 3靠近A蛋白金标垫2，检测线A 4位于质控线A 3以及检测线B 5的中间。

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其中，优选的，所述的左右两侧试纸条中间有折线16，所述折线16上涂覆有防水涂

层，可有效的阻隔了一边滴加液体时对另一侧试纸条的影响。[0011]其中，优选的，所述的底板17及/或底板18为PVC底板。[0012]其中，优选的，所述的样品垫A 1、样品垫B 13、吸水纸7以及吸水纸8均为高吸水纸。

[0013]其中，优选的，所述的吸水纸8由二层高吸水纸构成。[0014]所述的“高吸水纸”为采用高吸水纤维制成的吸水纸，相较于普通吸水纸，具有更高的吸水性能。其中吸水纸8由两张吸水纸构成，比上述其他结构吸水性能更强。[0015]其中，优选的，所述的A蛋白金标垫2上含有可复溶的胶体金-A蛋白单克隆抗体复合物，所述的B蛋白金标垫12上含有可复溶的胶体金-B蛋白单克隆抗体复合物。[0016]其中，优选的，所述的A蛋白与B蛋白为同源物种中不同蛋白或两种非同源物种的两种蛋白。

[0017]其中，优选的，所述的检测线A 4包被有A蛋白单克隆抗体，所述的检测线B 5包被有B蛋白单克隆抗体，避免抗原抗体之间发生交叉反应。A蛋白单克隆抗体与B蛋白单克隆抗体分别识别不同的抗原决定簇，所述的质控线A 3包被有A蛋白抗抗体，所述的质控线B 11包被有B蛋白抗抗体。[0018]其中，优选的，所述的底板的宽度大于样品垫、金标垫、纤维素膜以及吸水纸的宽度。

[0019]采用本实用新型的试纸条进行两种抗原检测时，按照以下方法进行：[0020]将待检测样品蛋白悬浮液，值得注意的对于蛋白在组织胞内或核质中我们建议使用碧云天的RIPA裂解液(P0013K)与对应的蛋白酶抑制剂混合物(P1015)从而使得悬浮液的蛋白含量更高，增加试纸的灵敏度。将待检测样品蛋白悬浮液滴加到左侧试纸条14的样品垫A上，在毛细管层析作用下使待测悬液向试纸下方区域流动，当悬液经过A蛋白金标垫2可将胶体金-A蛋白单克隆抗体复合物δ从玻璃纤维膜上复溶，胶体金-A蛋白单克隆抗体复合物δ游离到悬浮液中，若样品中含有A抗原则其与胶体金-A蛋白单克隆抗体复合物δ结合，形成A抗原-A蛋白单克隆抗体-胶体金复合物β，复合物β与A金标区游离到悬浮液中未结合的A抗原的复合物δ在渗透作用下往下迁移，下方质控线A 3上包被有A蛋白的抗抗体，游离的复合物δ与A蛋白抗抗体结合使胶体金聚集在质控线A 3呈显色反应。悬浮液中的复合物β继续往下迁移当到达检测线A 4时，由于检测线A 4上固定有针对A抗原的单克隆抗体，根据双抗体夹心原理，复合物β可被固相抗体识别结合形成胶体金标记抗体-抗原-固相单克隆抗体复合物，此时胶体金聚集在检测线A上发生显色反应。[0021]当检测完A抗原后，静置一段时间待左侧试纸条14晾干后，可以检测B抗原，在右侧试纸条15下方区域的样品垫B 13上滴加B样品，在层析作用下样品向上方质控线B 11所在区域流动，当悬液经过B蛋白金标垫12可将胶体金-B蛋白单克隆抗体复合物α从玻璃纤维膜上复溶，胶体金-B蛋白单克隆抗体复合物α游离到悬浮液中，若样品中含有B抗原则其与胶体金-B蛋白单克隆抗体复合物α结合，形成B抗原-B蛋白单克隆抗体-胶体金复合物γ，复合物γ与B金标区游离到悬浮液中未结合的B抗原的复合物α在渗透作用下往上方迁移，上方质控线B 11上包被有B蛋白抗抗体，游离的复合物α与B蛋白抗抗体结合使胶体金聚集在质控线B 11呈显色反应。待质控线B 11变色后，将右侧试纸条15通过折线16盖向左侧试纸条

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14，此时右侧试纸条15上方的吸水纸8与下方的样品垫B 13、B蛋白金标垫12、纤维素膜10在左侧试纸条上形成逆流层析使得原来在右侧试纸条15上的待测物质B以及复合物α、γ在左侧试纸的上方迁移，与检测A蛋白的层析方向相反，从而实现待测样品可通过检测线B 5，由于检测线B 5上固定有针对B抗原的单克隆抗体，根据双抗体夹心原理，复合物γ可被固相抗体识别结合形成胶体金标记抗体-抗原-固相单克隆抗体复合物，此时胶体金聚集在检测线A上发生显色反应，进而实现检测。这里需要着重说明的是因为检测线A，B分别固定的是相应抗原的单克隆抗体，拥有不同的抗原决定簇，分别只对A抗原或B抗原有特异性，不会发生交叉反应。

[0022]较现有的试纸条和试剂盒检测相比，本实用新型的有益效果是：[0023](1)本实用新型的试纸条在结构上划分为左右两侧区域，每个区域分别包括两种蛋白各自的单克隆抗体，通过二次层析原理(正向逆向)。巧妙的实现了试纸从一次性到可重复性使用，本实用新型为家用以及实验室快速检测提供了方便快捷的途径。[0024](2)操作简单，快速、可以在一张试纸条上同时检测两种外源蛋白，不需要专门的仪器设备，可方便的于田间等现场直接进行检测。[0025](3)检测时间短；结果判定标准统一，即：当只有质控线发生显色反应，对应的检测线不发生显色反应时说明是阴性；当质控线发生显色反应，对应的检测线发生显色反应时说明是阳性；当质控线未发生显色反应，则检测结果为无效。附图说明

[0026]图1为本实用新型的结构示意图(俯视图)；[0027]图2为左侧试纸条的结构示意图(侧视图)；[0028]图3为右侧试纸条的结构示意图(侧视图)；

[0029]图4为右侧试纸条通过折线13盖向左侧试纸条后的示意图(俯视图)；[0030]图5为A蛋白检测结果示意图，其中分别示出了当检测结果为阳性、阴性以及无效时的显色情况；

[0031]图6为B蛋白检测结果示意图，其中分别示出了当检测结果为阳性、阴性以及无效时的显色情况；

[0032]图7为当检测A、B两种蛋白时的检测结果示意图，其中分别示出了当A、B蛋白检测结果均为阳性、A、B蛋白检测结果均为阴性、A蛋白检测结果为阳性/B蛋白检测结果为阴性、B蛋白检测结果为阳性/A蛋白检测结果为阴性以及无效时的显色情况；

[0033]图8为申请号为CN201620065094的专利申请所公开的试纸条的结构示意图；[0034]图9为申请号为CN200920244114的专利申请公开的试剂盒的结构示意图。[0035]附图标记说明：[0036]图1-7中：1-样品垫A；2-A蛋白金标垫；3-质控线A；4-检测线A；5-检测线B；6、10-纤维素膜；7-吸水纸；8-吸水纸(二层)；9-可视窗；11-质控线B；12-B蛋白金标垫；13-样品垫B；14-左侧试纸条；15-右侧试纸条；16-折线(折线处有防水涂层，有效的阻隔了一边滴加液体时对另一侧试纸条的影响)；17、18-PVC底板。[0037]图8中：a-样品垫，b-胶体金结合垫，c-两组中的一个衬板，d-纤维膜，e-第一检测线，h-第二检测线，f-第一对照线，i-第二对照线，g-吸水滤纸。

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图9中：1’-密封盒，2’-载样板，3’-Ep管，4’-载样孔。

具体实施方式

[0039]下面结合具体实施例来进一步描述本实用新型，本实用新型的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本实用新型的范围构成任何。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本实用新型的精神和范围下可以对本实用新型技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本实用新型的保护范围内。

[0040]如图1-图3所示，本实用新型的一种用于检测两种抗原的组合型胶体金免疫层析试纸条，其由可折叠(通过折线16，折线16处有防水涂层，有效的阻隔了一边滴加液体时对另一侧试纸条的影响)的左右两侧试纸条组成，其中：[0041]左侧试纸条14包括底板17以及位于底板上的从上到下依次相连的样品垫A 1、A蛋白金标垫2、纤维素膜6以及吸水纸7，在所述的纤维素膜6上设有质控线A 3、检测线A 4以及检测线B 5；样品垫A 1、A蛋白金标垫2、纤维素膜6以及吸水纸7在结合处上下叠加；

[0042]右侧试纸条15包括底板18、位于底板上方的吸水纸8以及位于底板下方的从上到下依次相连的纤维素膜10、B蛋白金标垫12以及样品垫B 13，在吸水纸8以及纤维素膜10中间开有可视窗9，在所述的纤维素膜10上设有质控线B 11，所述可视窗9的位置与检测线A 4以及检测线B 5对应，用于观察检测线A 4以及检测线B 5；纤维素膜10、B蛋白金标垫12以及样品垫B 13在结合处上下叠加。[0043]其中，所述的质控线A3、检测线A4以及检测线B 5平行于纤维素膜6的上下边，质控线A 3靠近A蛋白金标垫2，检测线A 4位于质控线A 3以及检测线B 5的中间。[0044]其中，所述的左右两侧试纸条中间有折线16，所述折线16上涂覆有防水涂层，可有效的阻隔了一边滴加液体时对另一侧试纸条的影响。[0045]其中，所述的底板17及底板18为PVC底板。[0046]其中，所述的样品垫A1、样品垫B 13、吸水纸7以及吸水纸8均为高吸水纸。[0047]其中，所述的吸水纸8由二层高吸水纸构成。[0048]其中，所述的A蛋白金标垫2上含有可复溶的胶体金-A蛋白单克隆抗体复合物，所述的B蛋白金标垫12上含有可复溶的胶体金-B蛋白单克隆抗体复合物。[0049]其中，所述的A蛋白与B蛋白为同源物种中不同蛋白或两种非同源物种的两种蛋白。

[0050]其中，所述的检测线A 4包被有A蛋白单克隆抗体，所述的检测线B 5包被有B蛋白单克隆抗体，避免抗原抗体之间发生交叉反应。A蛋白单克隆抗体与B蛋白单克隆抗体分别识别不同的抗原决定簇，所述的质控线A3包被有A蛋白抗抗体，所述的质控线B 11包被有B蛋白抗抗体。[0051]其中，所述的底板的宽度大于样品垫、金标垫、纤维素膜以及吸水纸的宽度。[0052]下面以转基因农作物的检测为例进行举例说明：[0053]1、试纸条的制备[00](1)提供可折叠PVC底板，大小为12mm×60mm，中间有折线16，将PVC底板平均分为

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两部分：左侧PVC底板17以及左侧PVC底板18；[0055](2)左侧试纸条14的制备[0056]左侧试纸条14包括PVC底板17以及位于底板17上的从上到下依次相连的样品垫A 1、A蛋白金标垫2、纤维素膜6以及吸水纸7，在所述的纤维素膜6上设有质控线A 3、检测线A 4以及检测线B 5；

[0057]A蛋白金标垫2上胶体金-鼠抗CP4-EPSPS蛋白的单克隆抗体的涂覆量为5ng-50ng，纤维素膜6上质控线A 3上包被羊抗鼠抗抗体的量为0.4μg-1.2μg，检测线A 4包被鼠抗CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体的量为0.4μg-1.2μg，检测线B 5包被鼠抗PAT/bar蛋白单克隆抗体的量为0.4μg-1.2μg。[0058]样品垫A 1的大小为5mm×4mm，A蛋白金标垫2的大小为3mm×4mm；纤维素膜15的大小为4mm×28mm；吸水纸6的大小为4mm×19mm。样品垫A 1以及吸水纸7均为高吸水纸构成.[0059](3)右侧试纸条13的制备

[0060]右侧试纸条15包括PVC底板18、位于底板上端的吸水纸8以及位于底板下端的从上到下依次相连的纤维素膜10、B蛋白金标垫12以及样品垫B 13，在吸水纸8以及纤维素膜10中间开有可视窗9，在所述的纤维素膜10上设有质控线B 11，所述可视窗9的位置与检测线A 4以及检测线B 5对应，用于观察检测线A 4以及检测线B 5。

[0061]B蛋白金标垫10上胶体金-鼠抗PAT/bar蛋白单克隆抗体的涂覆量为5ng-50ng，纤维素膜18上质控线B11上包被羊抗鼠抗抗体的量为0.4μg-1.2μg。[0062]样品垫B 13的大小为5mm×4mm，B蛋白金标垫12的大小为3mm×4mm；纤维素膜10的大小为4mm×10mm；吸水纸8的大小为4mm×19mm，可视窗9的大小为4mm×8mm。样品垫B 13以及吸水纸8均为高吸水纸构成，其中吸水纸8由二层高吸水纸构成。[0063](4)试纸条在温度为37℃下，干燥30min，即得。[00]2、转基因农作物大豆与水稻蛋白的联合检测[0065](1)蛋白悬浮液的制备[0066]为了提高蛋白收集效率，我们使用碧云天的RIPA裂解液(P0013K)与对应的蛋白酶抑制剂混合物(P1015)从而使得悬浮液的蛋白含量更高，增加试纸的灵敏度；[0067](2)将待检测大豆样品蛋白悬浮液，滴加到样品垫A 1上，在毛细管层析作用下使待测悬液向试纸下部区域流动，当悬液经过A蛋白金标垫2可将胶体金-CP4-EPSPS单克隆抗体复合物δ从玻璃纤维膜上复溶，胶体金--CP4-EPSPS单克隆抗体复合物δ游离到悬浮液中，若样品中含有CP4-EPSPS抗原则其与胶体金--CP4-EPSPS单克隆抗体复合物δ结合，形成CP4-EPSPS--CP4-EPSPS单克隆抗体-胶体金复合物β，复合物β与A金标区游离到悬浮液中未结合CP4-EPSPS的复合物δ在渗透作用下往下迁移，下方质控线A 3上包被有抗抗体，游离的复合物δ与羊抗鼠抗抗体结合使胶体金聚集在质控线A3发生显色反应。悬浮液中的复合物β继续往下迁移当到达检测线A 4时，由于检测线A4上固定有CP4-EPSPS的单克隆抗体，复合物β可被固相抗体识别结合形成胶体金标记抗体-抗原-固相单克隆抗体复合物(双抗体夹心)，此时胶体金聚集在检测线A 4上发生显色反应。[0068](2)当检测完大豆蛋白后，静置一段时间待左侧试纸晾干后，可以检测转基因水稻PAT/bar蛋白，在右侧区域的样品垫B 13上滴加转基因水稻PAT/bar蛋白悬浮液，在层析作

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用下样品向上方质控线B 11所在区域流动，待质控线B 11变色后，将右侧试纸条15通过折线16盖向左侧试纸条14(图4所示)，由于左侧上方的有高强吸水性的吸水纸8，使得在右侧试纸条上形成了逆方向层析，从而实现待测样品可通过检测线B 5，进而实现检测，通过可视窗9观察结果。[0069](3)结果判定

[0070]对于CP4-EPSPS蛋白：当只有质控线A发生显色反应，对应的检测线A不发生显色反应时说明是阴性；当质控线A发生显色反应，对应的检测线A发生显色反应时说明是阳性；当质控线A未发生显色反应，对应的检测线A出现显色反应或当质控线A未发生显色反应，对应的检测线A不发生显色反应则检测结果均为无效，示意图如图5所示。[0071]对于PAT/bar蛋白：当只有质控线B发生显色反应，对应的检测线B不发生显色反应时说明是阴性；当质控线B发生显色反应，对应的检测线B发生显色反应时说明是阳性；当质控线B未发生显色反应，对应的检测线B出现显色反应或当质控线B未发生显色反应，对应的检测线B不发生显色反应则检测结果均为无效，示意图如图6所示。[0072]当只有质控线A、质控线B发生显色反应，对应的检测线A、检测线B不发生显色反应时说明A、B蛋白均为阴性；当质控线A、质控线B发生显色反应，对应的检测线A、检测线B发生显色反应时说明A、B蛋白均为阳性；当质控线A、质控线B发生显色反应，对应的检测线A出现显色反应而检测线B未出现显色反应时说明A蛋白为阳性、B蛋白为阴性；当质控线A、质控线B发生显色反应，对应的检测线B出现显色反应而检测线A未出现显色反应时说明B蛋白为阳性、A蛋白为阴性；当质控线A、质控线B不发生显色反应时，则说明检测结果无效。示意图如图7所示。

[0073]实验证明采用本实用新型的试纸条检测转基因大豆CP4-EPSPS和转基因水稻蛋白PAT/bar，对叶片、种子和散粮等复杂基质具有较好的抗干扰效果，可广泛应用于两种不同抗原物质的检测。

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