MM_FS_CNJ_0151 出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）检验方法

MM_FS_CNJ_0151出口食品 沙门氏菌属(包括亚利桑那菌) 微生物法

MM_FS_CNJ_0151

     出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)检验方法

1.适用范围

    本方法适用于冻猪肉、冻鸡肉、鸡蛋黄粉和冰鸡蛋白中沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)检验。其他食品可参照使用。

2.培养基

2.1.营养肉汤(NB)

蛋白胨  10.0g；

酵母膏  3.0g；

氯化钠  5.0g；

葡萄糖  1.0g；

蒸馏水  1000.0Ml；

将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，调至pH7.5±0.1，分装试管(12mm×100mm)，每管约3mL，高压灭菌121℃，15min。

2.2.营养琼脂(NA)

蛋白胨  10.0g；

酵母膏  3.0g；

氯化钠  5.0g；

葡萄糖  1.0g；

琼  脂  12.0g；

蒸馏水  1000.0mL；

将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，调至pH7.5±0.1，分装试管(12mm×100mm)，每管约3mL，高压灭菌121℃，15min。

2.3.缓冲胨水增菌液(BP)

蛋白胨                    10.0g；

氯化钠                    5.0g；

磷酸氢二钠(含12个结晶水)  9.0g；

磷酸二氢钾                1.5g；

蒸馏水                    1000.0mL；

将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，调至pH7.2±0.1，高压灭菌121℃，15min，临用时，以无菌操作分装灭菌玻璃瓶，每瓶200mL或225mL。

2.4.亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)

蛋白胨                    5.0g；

乳  糖                    4.0g；

磷酸氢二钠(含12个结晶水)  10.0g；

亚硒酸氢钠                4.0g；

L-胱氨酸                  0.01g；

蒸馏水                    1000.0mL；

除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10min，加热煮沸5min至完全溶解，冷至55℃以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/Ll-胱氨酸溶液10mL(称取0.1gl-胱氨酸，加1mol/L氢氧化钠溶液15mL，使溶解，再加灭菌蒸馏水至100mL即成，如为DL-胱氨酸，用量应加倍)。摇匀，调至pH7.0±0.1，以无菌操作分装灭菌玻璃瓶内，每瓶100mL或200mL。

2.5  四硫磺酸盐煌绿增菌液(TTB)

2.5.1.基础液

蛋白胨  10.0g；

牛肉膏  5.0g；

氯化钠  3.0g；

碳酸钙  45.0g；

蒸馏水  1000.0mL；

除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，再加入碳酸钙，调至pH7.0±0.1，高压灭菌121℃，20min。

2.5.2.硫代硫酸钠溶液

硫代硫酸钠(含5个结晶水)  50.0g；

蒸馏水  加至100.0mL；

高压灭菌  121℃，20min。

2.5.3.碘溶液

碘  片  20.0g；

碘化钾  25.0g；

蒸馏水  加至100.0mL；

将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总量，贮存于褐色瓶内，塞紧瓶盖备用。

2.5.4.煌绿水溶液

煌  绿  0.5g；

蒸馏水  100.0mL；

溶解后，存放暗处，不少于1d，使其自然灭菌。

2.5.5.牛胆盐溶液

牛胆盐  10.0g；

蒸馏水  100.0mL；

加热煮沸至完全溶解，高压灭菌121℃，20min。

2.5.6.制备

基础液          900.0mL；

硫代硫酸钠溶液  100.0mL；

碘溶液          20.0mL；

煌绿水溶液      2.0mL；

牛胆盐溶液      50.0mL；

临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。最后分装于灭菌玻璃瓶内，每瓶100mL或225mL。

2.6.亚硫酸铋琼脂(BS)

蛋白胨      10.0g；

牛肉膏      5.0g；

葡萄糖      5.0g；

硫酸亚铁    0.3g；

磷酸氢二钠  4.0g；

煌  绿      0.025g或5g/L水溶液5mL；

柠檬酸铋铵  2.0g；

亚硫酸钠    6.0g；

琼  脂      18.0g；

蒸馏水      1000.0mL；

将前三种成分加入300mL蒸馏水中(制作基础液)，硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20mL和30mL蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20mL和30mL蒸馏水中，琼脂加入600mL蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解。冷至80℃左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调至pH7.5±0.1，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至50～55℃。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿，每皿约20mL。

本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，新配制的培养基呈玉白色不透明，贮于室温暗处，超过48h会降低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。

2.7.胆硫乳琼脂(胆盐  硫化氢  乳糖琼脂 dHL)：

蛋白胨      20.0g；

牛肉膏      3.0g；

乳  糖      10.0g；

蔗  糖      10.0g；

牛胆盐      2.0g；

硫代硫酸钠  2.2g；

柠檬酸钠    1.0g；

柠檬酸铁铵  1.0g；

中性红      0.03g或5g/L水溶液6mL；

琼  脂      16.0g；

蒸馏水      1000.0mL；

除中性红和琼脂外，将其他成分加入400mL蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，调至pH7.3±0.1。另将琼脂加入600mL蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解。将两种溶液混合后，再加入5g/L中性红水溶液6mL，搅拌均匀，冷至50～55℃，倾注平皿，每皿约20mL。

本培养基不需高压灭菌，也不再进行任何加热。制成的平板为橙黄色。

2.8.亚利桑那菌琼脂(SA)：

蛋白胨      12.0g；

酵母膏      3.0g；

牛胆盐      9.0g；

蔗  糖      12.0g；

丙二酸钠    6.0g；

卫矛醇      20.0g；

葡萄糖      1.0g；

氯化钠      5.0g；

硫代硫酸钠  5.0g；

柠檬酸铁铵  1.5g；

酚  红      0.04g或5g/L溶液8mL；

琼  脂      14.0g；

蒸馏水      1000.0mL；

除酚红和琼脂外，将其他成分加入400mL蒸馏水中，搅拌均匀，加热煮沸至完全溶解，调至pH7.1±0.1。

将琼脂加入600mL蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，冷至约90℃，将上述溶液加入琼脂中，摇匀，再加入酚红指示剂，混匀，冷至50～55℃，倾注平皿，每皿约20mL。

本培养基不需高压灭菌，制成的平板为透明桔红色。

2.9.三糖铁琼脂(TSI)：

蛋白胨                   20.0g；

牛肉膏                   3.0g；

乳  糖                   10.0g；

蔗  糖                   10.0g；

葡萄糖                   1.0g；

硫酸亚铁铵(含6个结晶水)  0.5g；

酚  红                   0.025g或5g/L溶液5mL；

氯化钠                   5.0g；

硫代硫酸钠               0.5g；

琼  脂                   12.0g；

蒸馏水                   1000.0mL；

除酚红和琼脂外，将其他成分加入400mL蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，调至pH7.4±0.1。另将琼脂加入600mL蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解。

将上述两溶液混合均匀后，再加入酚红指示剂，混匀，分装试管(12mm×100mm)，每管约2～4mL，高压灭菌121℃10min或115℃15min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。

2.10.赖氨酸脱羧酶培养基(LD)：

酵母膏    3.0g；

葡萄糖    1.0g；

L-赖氨酸  5.0g；

溴甲酚紫  0.016g或8g/L溶液2mL；

蒸馏水    1000.0mL；

除溴甲酚紫外，将其他成分加入蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，调至pH6.7±0.1，加入溴甲酚紫，混匀，分装试管(12mm×100mm)，每管1～1.5mL，高压灭菌121℃，15min。

试验与判断：接种待试菌，于37℃培养24±2h。阳性反应为紫色，阴性为黄色。

2.11.尿素酶琼脂(U)：

蛋白胨      1.0g；

葡萄糖      1.0g；

尿  素      20.0g；

氯化钠      5.0g；

磷酸二氢钾  2.0g；

酚  红      0.012g或5g/L溶液2.5mL；

琼  脂      15.0g；

蒸馏水      1000.0mL；

除酚红和尿素外，将其他成分加入蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，调至pH7.0±0.1，高压灭菌121℃，15min，冷至50～55℃，以无菌操作加入尿素20g(400g/L业经除菌过滤的尿素溶液50mL)和5g/L酚红溶液2.5mL，混匀，分装灭菌试管(12mm×100mm)，每管2～3mL，置成斜面。

试验与判断：大量接种待试菌于37℃培养24±2h，强阳性反应为深红色，弱阳性为粉红色，阴性为黄色或不变色。

2.12.V-P半固体琼脂(VP)

2.12.1.制备

蛋白胨  12.0g；

酵母膏  1.0g；

葡萄糖  10.0g；

氯化钠  5.0g；

琼  脂  3.0g；

蒸馏水  100.0mL；

将各成分加入蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，调至pH7.3±0.1，分装试管(12mm×100mm)，每管1～1.5mL，高压灭菌121℃，10min，灭菌后立即取出冷却备用。

2.12.2.试验判断

2.12.2.1.配制试剂

甲液：

α-萘酚       6.0g；

无水乙醇溶液  100.0mL；

乙液：

氢氧化钾      40.0g；

肌  酸        0.3g；

蒸馏水        100.0mL；

先将氢氧化钾溶于水中，再加入肌酸。

甲液和乙液保存于4℃冰箱中，可使用2个月。

2.12.2.2.试验

    接种幼嫩待试菌，于37℃培养24±2h，将甲液0.2mL(约6滴)加入试管中，摇混均匀，再加乙液0.1mL(约3滴)，再摇混均匀。

2.12.2.3.判断

    阳性反应立即或在15min内呈现红色，阴性为铜色。阴性结果在1h后再做一次检查。有些试管在数小时后红色会逐渐消失，此仍作阳性反应。

2.13.吲哚培养基(I)：

2.13.1.制备

蛋白胨     10.0g；

氯化钠     5.0g；

DL-色氨酸  1.0g；

蒸馏水     1000.0mL；

除DL-色氨酸外，将其他成分加入蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10min。另将DL-色氨酸加入约4mL 1mol/L氢氧化钠溶液中，待溶解后，再将两液进行混合并加热煮沸至完全溶解，调至pH7.4±0.1，分装试管(12mm×100mm)，每管1～1.5mL，高压灭菌121℃，15min。

2.13.2.试验与判断

2.13.2.1.配制试剂

柯凡克试剂：

对二甲氨基苯甲醛  10.0g；

戊  醇            150.0mL；

浓盐酸            50.0mL；

将色泽鲜明干燥的对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，缓慢搅拌加入盐酸，加热至60℃，呈深黄色，静置6～7h，变成黄色即可使用。试液宜小量配制，不用时保存于4℃冰箱内。久存后试液变成黄褐色不可使用。

2.13.2.2.试验

接种待试菌，于37℃培养24±2h，滴加柯凡克试剂0.1mL。

2.13.2.3.判断

阳性反应出现红色环；阴性为黄棕色环。

2.14.培养基(KCN)

2.14.1.制备

蛋白胨             10.0g；

氯化钠             5.0g；

磷酸二氢钾         0.225g；

磷酸氢二钠         5.g；

钾(无亚盐)  1.0g；

5g/L溶液    10.0mL；

蒸馏水             1000.0mL；

将蛋白胨、氯化钠和钾加入900mL蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，调至pH7.6±0.1，高压灭菌121℃，15min，取出置于4℃冰箱内进行冷却。

将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠溶于100mL蒸馏水，高压灭菌121℃，15min，取出进行冷却。

在冷却后的上述培养液900mL中，以无菌操作加入磷酸盐缓冲液100mL和5g/L溶液(必须用冷却的灭菌蒸馏水配制)10mL，摇混均匀(的最终浓度为0.05g/L)。并立即分装灭菌试管(12mm×100mm)，每管约1～1.5mL，同时加入约0.3mL灭菌石蜡油封盖。在4℃冰箱中可保存7d。

2.14.2.试验与判断

2.14.2.1.配制试剂

甲液：

氨基苯磺酸  0.8g；

5mol/L乙酸  100.0mL；

乙液：

α-萘胺  0.5g；

5mol/L乙酸  100.0mL；

2.14.2.2.试验

在三糖铁琼脂斜面上挑取少量菌苔，先接种于吲哚培养基中，混匀(使其浓度近似于37℃，24h肉汤培养物)然后烧灼接种环，再沾取吲哚培养基少许接种于培养基中，于37℃培养24±2h。培养之后，先观察培养液有无混浊，然后在每支培养物试管内滴加甲液1滴，然后再滴加乙液1滴，摇匀。

2.14.2.3.判断

强阳性反应为鲜红色，弱阳性为粉红色，在30～60min内，强阳性可转为暗褐色。阴性无变化(加试剂前，培养液出现混浊，即有细菌生长，亦为阳性反应)。

2.15.丙二酸钠培养基(M)

酵母膏        1.0g；

硫酸铵        2.0g；

磷酸氢二钾    0.6g；

磷酸二氢钾    0.4g；

氯化钠        2.0g；

丙二酸钠      3.0g；

葡萄糖        0.25g；

溴麝香草酚蓝  0.025g或5g/L溶液5mL；

蒸馏水        1000.0mL；

除溴麝香草酚蓝外，将其他成分加入蒸馏水中搅拌均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，调至pH6.9±0.1，加入溴麝香草酚蓝，再混匀，分装试管(12mm×100mm)，每管1～1.5mL，高压灭菌115℃，10min。

试验与判断：接种大量幼嫩待试菌，于37℃培养24±2h，阳性反应为普蓝色；阴性不变色。

2.16.卫矛醇半固体琼脂(D)

蛋白胨        2.0g；

酵母膏        1.0g；

卫矛醇        10.0g；

氯化钠        5.0g；

磷酸氢二钾    0.3g；

溴麝香草酚蓝  0.08g或8g/L溶液10mL；

琼  脂        2.5g；

蒸馏水        1000.0mL；

除溴麝香草酚蓝外，将其他成分加入蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，调至pH7.1±0.1，加入溴麝香草酚蓝，呈绿色，分装试管(12mm×100mm)，每管约1～1.5mL，高压灭菌121℃，15min，灭菌后立即取出，冷却备用。

试验与判断：穿刺接种待试菌，于37℃培养24±2h，阳性反应为黄色阴性不变色。

注：新制备的培养基均应用已知阳性及阴性菌进行测试，以保证培养基质量。

3.样品制备及增菌培养

3.1.肉类

    如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min，或在2～5℃不超过18h解冻。若不能及时检验，应置于－15℃左右保存。非冷冻而易腐的食品，置于4℃冰箱保存。

    以无菌操作，称取剪碎后的瘦肉样品25g，置于灭菌均质杯内，加入25mL缓冲胨水增菌液，以8000～10000r/min均质1min，移入盛有200mL缓冲胨水增菌液的500mL广口瓶内，混合均匀，如pH低于6.6，用灭菌1mol/L氢氧化钠溶液，调pH至6.8±0.2，于37℃水浴培养4h(以增菌液达到37℃时算起)，进行前增菌；其后，移取10mL转种于盛有100mL四硫磺酸盐煌绿增菌液的250mL玻璃瓶内，摇匀，于42±1℃培养20±2h，进行选择性增菌。必要时，同时另称取25g剪碎的瘦肉样品，加入25mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液，同样进行均质。其后，移入盛有200mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液的500mL广口瓶内，混合均匀，如pH低于6.6，用灭菌1mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.8±0.2，于37℃培养24±2h，进行直接选择性增菌。

3.2.蛋品

3.2.1.冰蛋品(冰鸡全蛋、冰鸡蛋白、冰鸡蛋黄)

    按2.1.1解冻和保存样品。

    以无菌操作称取样品25g，置于盛有225mL四硫磺酸盐煌绿增菌液的500mL广口瓶内，混合均匀，如pH低于6.6，用灭菌1mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.8±0.2，于37℃培养24±2h，进行直接选择性增菌。

3.2.2.干蛋品(鸡全蛋粉、鸡蛋白片、鸡蛋白粉、鸡蛋黄粉)

    以无菌操作将样品碾碎后，称取25g加入盛有225mL缓冲胨水增菌液的500mL广口瓶内(瓶内事先盛有直径3～4mm的玻璃珠约50粒)，振荡10min，如pH低于6.6，用灭菌1mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.8±0.2，于37℃培养20～24h，进行前增菌；其后，移取10mL转种于盛有100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液的250mL玻璃瓶内，混匀，于42±1℃培养20±2h，进行选择性增菌。

4.分离培养

4.1.将增菌培养液摇匀，以无菌操作，用直径3mm的接种环分别挑取1环，分别划线于表面无凝结水的亚硫酸铋和胆硫乳琼脂平板各一个(必要时亚利桑那菌琼脂平板可参照使用)，于37℃培养24±2h。

4.2.观察各琼脂平板上有无典型或可疑沙门氏菌属的菌落，如无典型或可疑菌落，应再继续培养24±2h。

沙门氏菌属的菌落特征见表1。

表1.沙门氏菌属菌落特征

5.鉴定

5.1.筛选试验

5.1.1.每个琼脂平板至少应挑选2个典型或可疑菌落，分别用接种针接种赖氨酸脱羧酶培养基或尿素酶琼脂一管，接种后无须灭菌接种针，直接再接种三糖铁琼脂一管于37℃培养24±2h。

5.1.2.挑取菌落后的琼脂平板，应置于4～8℃至少保留24h，以备必要时复查。

5.1.3.按表2或表3结果进行判断。

表2  三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶培养基筛选